11. Molekuladinamika és dokkolás.
Bioinformatikai programcsomagok.
Bioinformatika a gyakorlatban

Molekuladinamika

A fehérje mozgásainak szimulációja

A potenciálisenergia-felület

• Born-Oppenheimer-közelítés: az elektronok mozgása sokkal gyorsabb az atommagokénál, az atommagok nehezek
• Ezért a molekuláris mozgások modellezésénél a molekulát klasszikus rendszernek tekinthetjük: rugókkal összekötött, töltéssel rendelkező tömegpontok.
• Az atommagok pozícióitól függő E(R) potenciálfüggvényt empirikus energiafüggvénnyel helyettesíthetjük (a Schrödinger-egyenlet megoldása helyett)
• Az atommagok mozgásának leírására használhatjuk a Newton-féle mozgásegyenletet:
  -(dE/dR) = m(d²R/dt²)
  Ez a molekuladinamika.

A forcefield

• A forcefield az empirikus energiafüggvény matematikai alakja. Egy tipikus forcefield:
  
  Az egyes tagok jelentése:
  
  
  • 1. kötések nyújtása (Morse-potenciál vagy egyszerű harmonikus potenciál)
  • 2. kötésszögek változtatása
  • 3. torziós szögek változtatása
  • out-of-plane kölcsönhatások (atom kitérése sík csoportból)
  • 5-9. kereszttagok (csatolások az 1-4. effektusok között)
  • 10. Van der Waals
  • 11. Coulomb
• A képletben szereplő paraméterek értékét empirikus adatok (pl. kristályszerkezet, rácsdinamika, röntgenadatok, sűrűség, párolgáshő, stb.) alapján illesztik, néha ab initio kvantumkémiai számítások eredményeit is felhasználják.
• Az empirikus adatok miatt a forcefield implicit módon magában foglalja a relativisztikus és kvantummechanikai effektusokat is.
• Ismertebb forcefieldek fehérjékhez: AMBER, CHARMM, ECEPP, GROMOS, CVFF

A párkölcsönhatások problémája

• A párkölcsönhatások száma négyzetesen nő a rendszer méretével, ez nagyon megnöveli az energiafüggvény kiértékeléséhez szükséges időt.
• Megoldás: cutoff (határtávolság) alkalmazása: a cutoffnál (10-20 angström) messzebb lévő párok kölcsönhatását nem vesszük figyelembe (ez különféle problémákhoz vezet, amelyek azonban jól kezelhetőek).

Az oldószer modellezése

• Explicit: vízmolekulákkal körülvesszük a vizsgált molekulát (néhány réteg vagy egy feltöltött doboz (periodikus határfeltétellel))
• Implicit: a potenciált módosítjuk, pl. távolságfüggő dielektromos állandó, kétféle dielektromos állandó, stb.

Eljárások

Energiaminimalizálás

• Cél: a potenciálfelület minimumainak megkeresése (ezek körül fluktuál a konformáció). Modellszerkezetek optimalizálására is jó.
• Legmeredekebb esés módszere: mindig az energiafelület deriváltjának irányába lépünk.
  
  Az energiaminimumtól távol jól konvergál, hozzá közel rosszul.
• Konjugált gradiensek módszere: a lépésirányt az előző lépések deriváltjainak felhasználásával korrigáljuk. Ez a módszer nagy rendszereknél és a minimumok közelében is gyorsan konvergál.

Molekuladinamika

• Cél: a rendszer dinamikájának feltárása, konformációs mozgások szimulálása
• dt lépésköz: 1-2 femtoszekundum
• Módszer:
  • Az atomoknak kezdeti sebességeket adunk (a kívánt hőmérsékletnek megfelelő nagyságú és eloszlású atomi sebességek)
  • A rendszer mozgását a Newton-féle mozgásegyenletek alapján szimuláljuk (az energiafüggvényből számítjuk az erőket, ezekből a gyorsulásokat, a sebességeket és a pozíciók változásait; többféle módszer)
• Végezhető szimuláció állandó hőmérsékleten (hőtartályhoz csatolt rendszer) és állandó nyomáson

A fehérjemolekulák belső mozgásainak típusai

A molekuladinamika korlátjai

• A számítógépek jelenlegi teljesítőképessége mellett a szimulálható időtartam korlátozott. Fehérjemolekulán az eddigi rekord 1 mikroszekundum szimulációja (1 hónapig tartott egy 256 processzoros szuperszámítógépen). Korszerű módszerekkel ez még növelhető kb. egy nagyságrenddel
• A klasszikus mechanikai modell nem alkalmas kémiai események szimulálására (pl. ionizáció, protontranszfer, stb.)

Mire használható a molekuladinamika?

• Szerkezetfinomítás: még tökéletlen minőségű modellszerkezetek finomíthatóak vele
• Szerkezetjóslás: mutáns fehérje szerkezete jósolható (kicseréljük az oldalláncot, majd molekuladinamikával relaxáljuk a szerkezetet).
• Dokkolás: ligandum v. szubsztrát kötődési helyének megtalálása egy fehérje felszínén (kevésbé megbízhatóan)
• Fehérjemolekulák fontos funkcionális mozgásainak feltérképezése: pl. domének relatív mozgásai enzimkatalízis során, stb. (kevéssé megbízhatóan)
• Fehérjemolekulák le- és felgombolyodásának szimulációi: a mechanizmus felderítése céljából

Molekuladinamikai programok

• (Fél)kommerciális: Discover, AMBER, GROMOS
• Ingyenes: NAMD, Gromacs

Dokkolás

Benzamidin dokkolása tripszinhez

• Kismolekula (ligandum, szubsztrát, koenzim, stb.) kötődési helyének megtalálása egy fehérje (receptor) felszínén
• Két fehérje egymáshoz való kötődési helyének megtalálása

Eljárás lényege: az egyik molekula mozgatása és forgatása a másik felszínén, eközben az illeszkedés értékelése.

Az illeszkedés értékelésének módja szerint:

1. Egyszerű geometriai illeszkedés figyelembe vétele
2. Az illeszkedés kiértékelése bonyolult energiafüggvénnyel, elektrosztatikus komplementaritás, stb.

A modell szerint:

1. Mindkét molekula merev
2. Az egyik molekula (ált. a ligandum) flexibilis, a másik (ált. a fehérje) merev
3. Mindkét molekula flexibilis (a keresés nagyon időigényes)

Az algoritmus szerint:

• Molekuladinamika
• Monte Carlo módszerek (pozíciók véletlenszerű generálása)
• Szimulált hőkezelés: szimuláció során magas hőmérsékletről indulva lassan lehűtjük a rendszert, ez elősegíti az energiaminimum elérését
• Egyéb trükkök

Programok: DOCK, AutoDOCK, FTDOCK, GRAMM, stb. (weben elérhetőek)

Eredményesség

• Kismolekula fehérjére dokkolásakor jó eredmények érhetőek el, de bonyolultabb esetekben (pl. nagy fehérje, nagy és flexibilis szubsztrát) csak kísérleti adatok ismeretében érhető el jó eredmény
• Fehérje-fehérje dokkolás: bizonytalan, gyenge eredmények

Bioinformatikai programcsomagok

A programcsomagok használatának előnyei a különféle webes szolgáltatásokkal és különböző eredetű programokkal szemben:

• Egységes kezelés, ki- és bemenő formátumok
• Nem kell a szekvenciákat idegen szerverekre elküldeni (pl. ipari célú kutatás esetén ez aggályos lehet).
• Kommerciális csomagok esetében van támogatás

Hátrányok viszont:

• Többnyire nincs meg néhány új, korszerű bioinformatikai eljárás
• Nagy hardver- és háttértárigény

Átfogó programcsomagok szekvenciaanalízisre

Wisconsin csomag (GCG)

• Kommerciális csomag, unixos nagygépekre
• Nem olcsó, de az EMBnet csomópontokon hozzáférhető (Magyarországon a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Központnál igényelhető a hozzáférés).
• Parancssor üzemmódú programok, melyekhez van grafikus felhasználói felület is (SeqLab)
• Több mint 130 program, a következő kategóriákban:
  • Szekvenciák összehasonlítása:
    
  • Keresések adatbázisokban (BLAST, FASTA, Prosite-ban Motifs, stb.)
  • RNS másodlagos szerkezetének jóslása:
    
  • Szekvenciák szerkesztése, ábrakészítés. Plazmidtérkép:
    
  • Filogenetikai analízis
  • DNS-szekvenciák összeállítása fragmentumokból
  • Gének megkeresése, mintafelismerés. Hatkeretes transzláció:
    
  • Különféle formátumú adatfájlok konverziója
  • Térképezés. Restrikciós enzimek hasítási helyei:
    
  • Primertervezés (génklónozáshoz)
  • Fehérjeszekvenciák elemzése. Pl. hélixkerék:
    
  • Transzláció

Staden csomag

• Akadémiai felhasználásra ingyenes, kommerciálisra pénzbe kerül
• UNIX/LINUX-ra. Windows változatok előkészületben.
• Sokféle program nukleotidszekvencia-analízisre
• Erőssége: a szekvenálást segítő programok
  
  Szekvencia összeszerelése darabokból, a fluoreszcens szekvenáló gél leolvasási adataival együtt

Lasergene csomag

• Átfogó kommerciális csomag Windowsra és Macintoshra
• Moduljai:
  • Szekvenciaösszeszerelés
  • Gének megtalálása, annotáció
  • Fehérjeszekvencia-elemzés
    
  • Összerendezések
  • Primertervezés
  • Térképezés
  • Szekvenciák szerkesztése

EMBOSS

• Ingyenes, "Open source" programcsomag, folyamatos fejlesztés alatt
• A GCG-hez hasonló (annak bővítéseként keletkezett, majd függetlenné vált), de grafikus felhasználó felület nélkül
• Kb. 100 program

Specializáltabb programcsomagok

Alfresco

• Összehasonlító genomanalízisre szolgál
• Ingyenes, fejlesztés alatt van, letölthető és Java verzió
  
  Az egér és az ember egy genomrészletének összehasonlítása

VectorNTI, MacVector

• Elsősorban a molekuláris biológiai laboratóriumi munkákat könnyítik meg (klónozás, primertervezés, PCR, stb.)
• Windows, Macintosh

"Bővített" szekvenciaeditorok

• A többszörös szekvencia-összerendezések szerkesztésére való programok némelyike komolyabb szekvenciaelemző eljárásokkal is ki van egészítve, pl. transzláció, dotplotok, hélixkerekek készítése, stb.
• Ingyenesek: BioEdit, CINEMA, stb.

Bioinformatika a gyakorlatban

Az eddig tanultak szintézise.

A szekvenciaanalízis egy javasolt stratégiája