10. Genomika 2.

Microarray technikák és bioinformatikai vonatkozásaik

Microarrayek és típusaik

• Microarray (v. chip): kisméretű üveg- v. műanyag lap, melyre négyzetrács szerinti elrendezésben biológiai mintákat visznek föl, minden pontba mást. A vizsgált biológiai anyagot ezzel hozzák kölcsönhatásba, és valamilyen módon detektálják, mely pontokban jött létre kölcsönhatás.
• Típusai:
  • DNS microarray (oligonukleotid vagy cDNS)
  • Peptid v. fehérje microarray
  • Élő sejtek microarray-en (pl. élesztőtenyészetek)

DNS microarray-ek

• Készítésük: az egyes DNS-darabokat robot helyezi el a megfelelő helyekre, vagy helyben szintetizálják őket
• Nagy sűrűségűek: egy 1x1 cm méretű lemezkén több százezer pontban helyezkedhetnek el a különböző DNS-ek
• Elhelyezhető rá pl. nagyszámú különböző gén cDNS-e, pl. az élesztő mind a 6000 génje egyetlen lemezkén
• Alkalmazás: a fluoreszcensen jelölt vizsgált mintát (pl. cDNS-állomány) hibridizáltatni próbáljuk a microarray-en lévő DNS-ekkel. A nem hibridizáltakat lemossuk, fluoreszcencia detektorral leolvassuk, mely pontokban történt hibridizáció

A DNS microarray-ek alkalmazásai

• A globális génexpresszió megfigyelése
• "Ujjlenyomat" készítése: az arrayre felvitt gének ismerete nélkül is detektálhatjuk a génexpresszióban beálló változásokat
• A teljes genomot feldarabolva, genetikai különbségeket detektálhatunk
• stb.

Génexpresszió megfigyelése DNS microarray-ekkel

• Alapfeltevés: az mRNS-szint jellemzi az adott gén expressziós szintjét és az adott fehérje mennyiségét is (nem teljesen igaz, de jó közelítés)
• A sejt különböző állapotaiban (pl. sejtciklus különböző fázisai, ill. más-más környezet, tápanyagkészlet, stb.) vehetünk mRNS-mintát és microarray segítségével jellemezhetjük az egyes gének expressziós szintjét.
• Pl. két különböző állapot összehasonlító vizsgálata:
  
  • Kétféle élesztősejt: vegetatív, ill. spóraképző állapotú
  • mindkettőből kivonjuk a teljes mRNS-t, reverz transzkriptázzal cDNS-t készítünk
  • Az egyik mintát pirosan, a másik mintát zölden fluoreszkáló jelöléssel látjuk el
  • A kettő keverékét felvisszük a microarray-re, amely az összes élesztőgén mintáját tartalmazza. A nem hibridizáltakat lemossuk
  • Fluoreszcenciadetektorral leolvassuk, melyik pontra milyen mértékben kötődött a pirossal, ill. a zölddel jelölt DNS.
  • Ebből a kétféle állapotban expresszálódó gének azonosíthatóak
• A valóságos microarray képe (kinagyított részletekkel):
  

Korrelált génexpresszió mint a funkcionális genomika eszköze

• Az ugyanolyan körülmények között mindig együtt, azonos mintázat szerint expresszálódó gének között funkcionális kapcsolat valószínűsíthető
• Bioinformatika újabb feladata: a microarray-adatok elemzése, kiértékelése

Génexpressziós profilok az élesztő sejtciklusának egyes fázisaiban

• Élesztősejteket szinkronizáltak (sejtciklusukat (a))
• Két ciklus során tízpercenként (18 alkalommal) vettek mintát a sejtekből, melyek mRNS-állományából cDNS-t készítettek
• Ezeket az összes (6000) élesztőgént tartalmazó microarrayekkel hibridizáltatták, így minden gén expressziós szintjét megmérték
• A 6000-ből 409 gén mutatott jelentős ingadozást az expressziós szintben, ezeket vizsgálták tovább
• A 409 gént klaszterezték (csoportosították) az időbeli expressziós mintázataik (ezek korrelációi) szerint (b: piros: nagy expresszió, kék: kis expresszió). A fastruktúra (dendrogram) ezt a hierarchikus csoportosítást mutatja
• Időbeli expressziós viselkedésük (d) szerint a 409 gént 5 nagy csoportba sorolták (c)
• (e: bizonyos gének helye a dendrogramban, most nem érdekes)

Az expressziós adatok klaszteranalízise

• Legfontosabb elemző eljárás
• Klaszterezés: egy halmaz elemeit egymáshoz való közelségük alapján csoportokba soroljuk. Lehet egyszerű vagy hierarchikus:
  

  Egyszerű klaszterezés

  

  Hierarchikus klaszterezés

• Sokféle módszer, algoritmus

Egyéb elemző eljárások

• Belső elemzés: csak magukat az expressziós adatok elemezzük, máshonnan származó funkcionális v. szerkezeti információ felhasználása nélkül
  • Főkomponens-analízis (principal component analysis, PCA)
  • Egyszerű klaszterezési eljárások (SOM, k-means)
  • Hierarchikus klaszterezés
• Külső elemzés: Az expressziós adatokat összefüggésbe hozza funkcionális vagy szerkezeti információval
  • SVM (support vector machine): matematikai eljárás, a megadott funkcionális kategóriák szerint igyekszik szétválogatni az expressziós adatokat
• Kiforratlan eljárások, sok nyitott kérdés (pl. nem világos, mi a jó funkcionális csoportosítás)

Kombinált megközelítés a funkcionális genomikában

Az in silico funkcionális genomikai módszerek és a korrelált génexpressziós adatok kombinálása a legeredményesebb.

Pl. az élesztőre elvégezve, a következő típusú eredmények adódtak:

Sok a bizonytalanság, kísérleti megerősítés szükséges

Genomikai adatbázisok

DIP: Database of Interacting Proteins (a kölcsönható fehérjék adatbázisa)

• Egymással kölcsönhatásba lépő (egymást kötő) fehérjékről gyűjt adatokat, kísérleti eredmények alapján
• Kb. 6200 fehérjéről kb. 11 000 kölcsönhatást ír le
• Egy kölcsönhatás adatai: egyik fehérje, másik fehérje, kölcsönható régiók, kísérleti módszerek, disszociációs állandó, irodalmi hivatkozások.
  Példa.
• A kölcsönhatás-hálózatokat gráffal is szemlélteti (a csomópontok kattinthatóak). Pl.:
  
• Felhasználása: a meglévő adatok tárolása mellett új kölcsönhatások megsejtésére is felhasználható

KEGG: Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes

Céljai:

• Számítógépesíteni a jelenlegi molekuláris és sejtbiológiai ismereteket, adatbázisban tárolva az egymással kölcsönható, anyagcsere- vagy jelátviteli útvonalhálózatokat és szereplőiket --> PATHWAY adatbázis
• Katalógusokat fenntartani az ismert teljes genommal rendelkező élőlények génjeit, s a géntermékeket összekapcsolni a megfelelő útvonalhálózat-komponenssel --> GENES adatbázis
• Adatbázisba foglalni az élő sejtekben előforduló összes kémiai vegyületet, és ezeket összekapcsolni a megfelelő útvonalhálózat-komponenssel --> LIGAND adatbázis
• Új bioinformatikai módszerek kidolgozása a funkcionális genomika céljaira: útvonal-összehasonlítás, útvonal-rekonstrukció, útvonaltervezés

Séma:

A KEGG a japán DBLINK (GENOMENET) adatbázisrendszerbe illeszkedik be.

• PATHWAYS: anyagcsere- és jelátviteli útvonalhálózatokat tartalmaz, pl. a citromsavciklus ebben:
  

  Minden komponens (enzim, vegyület) kattinható, mire előjön a megfelelő bejegyzés a LIGAND adatbázisból

• GENES: a meglévő teljes genomok génjei, ortológ csoportokba szervezve, hozzárendelve az útvonalakhoz. Összekapcsolva a GENOMES adatbázissal.
• LIGAND: kismolekulák, pl. enzimszubsztrátok, valamint enzimek adatbázisa, megadja a hozzájuk tartozó reakciókat, útvonalelemeket, az enzimekhez a géneket a GENES adatbázisban megadva
• BRITE: fehérje-fehérje kölcsönhatások

Használat:

• útvonalak felől elindulva megkereshetjük az adott útvonalhoz tartozó géneket
• gének felől elindulva az útvonalakat
  
  
  
• Műveletek útvonalakkal:
  • Útvonal-rekonstrukció: az útvonalhálózat összeállítása az egyes elemek közötti páronkénti kapcsolatokból. Ennek során fény derül az esetlegesen hiányzó elemekre, ami új gének felfedezéséhez, ill. eddig ismeretlen funkciójú gének funkciójának megjóslásához vezethet el.
  • Útvonalak összehasonlítása: a különböző fajok útvonal-hálózatainak egymásra illesztése alapján megtalálhatóak az azonosságok és a különbségek, evolúciós események tárhatóak fel.
  • Útvonalak elemzése: az útvonalak alapján számos új információ nyerhető, pl. génduplikációk ismerhetőek fel, következtetni lehet a génexpresszió szabályozására (pl. egy operonban elhelyezkedő géneknek az útvonalhálózatban elfoglalt helye alapján, stb.)
  • Új útvonalak tervezése: Összehasonlítások és elemzések alapján, átlátva az egész útvonalhálózatot, lehetőség nyílik arra, hogy a hálózatot valamilyen célnak megfelelően módosítsuk, pl. egy hatékonyabb növényvédőszer vagy kevesebb mellékhatással bíró gyógyszer létrehozása érdekében.

Más, hasonló adatbázisok

• A KEGG-hez nagyon hasonló a WIT (What Is There) adatbázis
• Organizmusokra specifikus, részletesebb adatbázisok, pl. EcoCyc (E. coli), stb.

SNP: Single Nucleotide Polymorphisms (egynukleotidos polimorfizmusok adatbázisai)

• A humán genomról van szó
• SNP: olyan pozíció a genomban, amelyen nemkonzerválódott nukleotid van. Az 1%-nál ritkábban előforduló változatokat mutációknak nevezzük, ha ennél gyakoribb változatok vannak, akkor polimorfizmusról beszélünk.
• SNP konzorcium: kutatók és cégek társulása, az emberi genom SNP-inek felderítésére
• Emberi genomban becslés szerint 3 millió SNP hely van, ebből ma kb. 1 250 000 ismert (SNP adatbázisban).
  Példa

Jelentősége

• Betegségre való hajlam, ill. gyógyszerre való fogékonyság/érzékenység detektálása
  

  A beteg/fogékony/érzékeny emberekben egyes SNP-helyeken bizonyos allélek gyakorisága eltérhet a normális emberekétől, ennek alapján genetikai teszttel a beteg/fogékony/érzékeny emberek bizonyos valószínűséggel azonosíthatóak

• Betegségért, ill. gyógyszerre való fogékonyságért/érzékenységért felelős gén feltérképezése: Linkage disequilibrium mapping

Linkage disequilibrium mapping

• Linkage disequilibrium (LD) ("a kapcsoltság egyensúlytalansága"): azt mondjuk, hogy egy kromoszómán lévő két markerpozíció között linkage disequilibrium áll fenn, ha a két pozíción található alléleket tekintve bizonyos allélkombináció gyakorisága eltér az egyes allélek gyakoriságának szorzatától.
  Példa: két SNP pozíció, mindkettőn 50-50% gyakorisággal A, ill. G van, de a kettőt nézve AG együtt fordul elő az esetek 40%-ában, 25% helyett. (Ha nincs LD a két pozíció között, akkor az AG kombinációnak 50%x50%=25% gyakorisággal kell előfordulnia.)
• Az LD oka: amikor az egyik helyen mutációként kialakul az egyik változat, a másik helyen egy meghatározott változat van, így ez a kombináció rögződik.
• A generációk egymásutánjában a két pozíció közötti rekombinációk miatt a kapcsolat az idő előrehaladtával egyre inkább fellazul, az allélkombináció gyakorisága közeledik az egyensúlyi értékhez (a két allélgyakoriság szorzatához)
• A két pozíció közötti rekombináció valószínűsége növekszik a pozíciók távolságának növekedésével, ezért az LD mértéke a távolság növekedésével csökken

• Következmény: Betegséget, ill. gyógyszerre való fogékonyságot/érzékenységet okozó (mutáns) gén közelében (ha a mutáció nem nagyon régi eredetű) az SNP pozíciókban megfigyelhető allélgyakoriságok eltérnek a normális embereknél megfigyelhető gyakoriságoktól, a mutáció és az SNP hely közötti LD miatt!
• Az LD mértéke: valamely SNP allél gyakorisága a beteg/érzékeny/fogékony emberekben mínusz ugyanez a normális emberekben.
• Mivel az LD mértéke nő a két pozíció közötti távolság csökkenésével, sok SNP adatait felhasználva a betegséget/fogékonyságot/érzékenységet okozó gén helye a kromoszómán behatárolható
  

  Az Alzheimer-kórért felelős egyik gén behatárolása LD térképezéssel

• Minél sűrűbben helyezkednek el az SNP-k, annál jobb felbontással határolhatjuk be a keresett géneket.