7. Fehérjeszekvenciák és -térszerkezetek analízise.

Egyszerű elemzések (lásd Expasy Tools)

Fehérjeazonosítás

• AACompIdent: fehérje azonosítása aminosav-összetétel alapján. Megadható még az izoelektromos pont (pI) és a molekulatömeg (Mw). Eredmény: rangsorolt lista a SWISSPROT-ban lévő, a megadott adatokhoz közeli paraméterekkel rendelkező fehérjékről. Távoli homológiák detektálhatók ezen a módon!
• PROPSEARCH: A megadott szekvenciából (csak az aminosav-összetételből) 144 tulajdonságot számít ki (pl. nagy és kis oldalláncok részaránya, átlagos hidrofobicitás, átlagos töltés, bizonyos dipeptidek gyakorisága, stb.) Ezek alapján keres hasonlót a szekvenciaadatbázisokban. Távoli homológiák detektálhatóak vele!

Fehérjeazonosítás tömegspektrometriai eredmények alapján

Tömegspektrometria: valamilyen specifikus proteázzal (pl. tripszin) való emésztés után megadja a kapott peptidek pontos molekulatömegét. Ennek alapján a fehérje azonosítható.

Leggyakrabban használt módszer: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry)

A fehérjét (annak fragmentumait) UV-elnyelő anyagba ágyazzák (mátrix), ezt a réteget UV lézerrel lövik, mire a molekulák ionizálódnak és leválnak a mátrixról. Elektromos térben felgyorsulnak, detektor méri a becsapódást. A becsapódásig eltelt időből számítható a tömeg. Spektrum:

• MOWSE: megadva az emésztéshez használt proteázt és a peptidtömegeket, rangsorolt listát ad az OWL adatbázisban lévő, a megadott adatoknak megfelelő fehérjékről

Fizikai tulajdonságok a szekvenciából

• ProtParam: a szekvenciából egy sor mennyiséget számít ki (Mw, pI, aminosav- és atomösszetétel, extinkciós koefficiens, stb.)
• PeptideMass: a megadott szekvencia proteolitikus emésztési fragmentumainak tömegét számítja ki
• SAPS (Statistical Analysis of Protein Sequences): rengeteg fizikai és kémiai információt számít a szekvenciából (aminosav-összetétel, töltéseloszlás, pozitív és negatív töltésű klaszterek, mintázatok, hidrofób szegmensek, repetitív régiók, periodicitás, stb.)

Térszerkezet-predikció

A probléma bonyolultsága

• Általánosságban: találjuk meg egy tetszőleges szekvencia azon konformációját, amely a szabadentalpia globális minimumát adja.
• Egyszerű modellekben kimutatható: a feladat ún. NP-nehéz, vagyis a megoldásához szükséges idő a (fehérje)mérettel nempolinomiális függvény szerint (hanem annál gyorsabban) növekszik. (Vagyis bizonyos mérethatár fölött nem megoldható.)
• Gyakorlatban:
  • a valódi fehérjék szekvenciái nagyon specifikusak (evolúció során kiválogatódtak);
  • a predikcióhoz felhasználhatjuk a már ismert térszerkezeteket mint tudásbázist
• A gyakorlatban tehát a probléma kezelhető.

A predikció szintjei

(1D, 2D és 3D információ. A 2D a kontaktustérkép.)

• 1D: aminosavakhoz köthető tulajdonságok, melyek 1D stringként írhatóak fel. Pl.: szekvencia, másodlagos szerkezet, oldószer általi hozzáférhetőség, hidrofobicitás
• 2D: aminosavpárok közötti távolságok, kontaktusok
• 3D: az összes atomi koordináta

1D predikciók

Másodlagos szerkezet jóslása a szekvenciából

A fontosabb módszerek az Expasy - Tools oldalról elérhetőek.

Módszerek (rengeteg van, ez csak néhány példa):

• 1. és 2. generációs módszerek: az egyes aminosavaknak a különböző másodlagos szerkezetekben való előfordulásának gyakoriságai alapján dolgoznak. Pontosság <70%, béta-szerkezetre csak 28-48%, túl rövid hélixek és béta-szálak
  • Chou-Fasman: Alfa-hélixet indít ott, ahol 6 egymás melletti aminosav közül 4-nek 1,03 a hélixben levési valószínűsége, béta szálat ott, ahol 5 egymás melletti aminosav közül 3-nak legalább 1,0 a bétában levési valószínűsége. Ezután a hélixeket és béta-szálakat kiterjeszti mindkét irányba addig, amíg 4 egymás melletti aminosav átlagos hélix-, ill. béta-képzési valószínűsége 1,0 alá nem esik. Béta-kanyar jóslása hasonló módon.
  • GOR (Garnier-Osguthorpe-Robson): 17 aminosav szélességű ablakban vizsgálja az aminosavak előfordulását, ezek alapján jósolja az ablak középső pozíciójában lévő aminosavhoz tartozó másodlagos szerkezetet
• 3. generációs módszerek: a vizsgált szekvenciákhoz hasonlóakat keresnek és ezekből többszörös összerendezést készítenek, majd a többszörös összerendezésekben rejlő információt használják fel. A többszörös összerendezések információt tartalmaznak az együtt mutálódó aminosavakról (korrelált mutációk), ezek többnyire a térszerkezetben egymáshoz közel vannak, tehát a többszörös összerendezés információt tartalmaz a fehérje harmadlagos szerkezetéről, ily módon segíti a másodlagos szerkezet jóslását.
• Konszenzusos módszerek: több más módszert (2. és 3. generációs módszereket) alkalmaznak, az eredmények konszenzusát veszik. Pl. JPRED: Példa

PHD módszer (ma a legjobb, akár 77% pontosság) [Burkhard Rost]

1. adatbázisból kikeressük a rokon szekvenciákat (BLAST program)
2. Elkészítjük ezek többszörös összerendezését (MaxHom program)
3. Az összerendezés szűrése, jó homológok megtartása, újból összerendezés
4. A végső összerendezés alapján mindegyik pozícióra elkészítjük az előforduló aminosavcserék profilját
5. Ez szolgál bemenetként a neuronhálózatnak

Bár a PHD módszer a legjobbnak látszik, mégsem mindig az, ezért helyes, ha konszenzus módszert alkalmazunk, ill. több módszert együtt.

Oldószer általi hozzáférhetőség predikciója

• Felszíni vagy eltemetett az oldallánc
• Kezdetleges predikció: az oldallánc hidrofobicitása alapján --> gyenge eredmény
• Jobb predikció: evolúciós információ bevitele többszörös összerendezések útján --> 75% pontosságú jóslás (PHDacc)

Transzmembrán hélixek predikciója

Transzmembrán fehérjék topológiája

• Három állapot: bent, kint, membránban
• Hidrofobicitási plot: valamilyen hidrofobicitási skála (itt: Kyte-Doolittle) alapján, simítással. Pl. egy transzmembrán fehérjére a ProtScale programmal:
  

  Jó, de durva becslést ad a transzmembrán régiókra.

• Kifinomultabb módszerek; a többszörös összerendezést használók itt is eredményesek (>95% pontosság) Pl. TMPRED, HMMTOP.
• Legpontosabbnak tűnik: rejtett Markov-modell (HMMTOP by Tusnády Gábor): közel 100%. De: kevés az ismert szerkezet, így kevéssé ismert a megbízhatóság.

2D predikciók

Oldallánc-kontaktusok predikciója

• Az összes kontaktusból elvben felépíthető a 3D szerkezet
• Próbálkoztak kontaktusokat jósolni a következők alapján:
  • szekvenciában távoli aminosavak együtt előforduló (korrelált) mutációi
  • statisztika
  • átlagtér-potenciálok
  • neuronhálózatok
• Az eddigi eredmények nem kielégítőek

Fehérjeszerkezetek elemzése

Célja: a működés mechanizmusának részletes megértése, az egyes szerkezeti motívumok felismerése, jelentőségük feltárása, stb.

Minőségellenőrzés

• PDB-ben lévő szerkezetek nagy része tökéletlen, hibákat tartalmaz. A modellezéssel nyert szerkezetek még inkább.
• Minőségellenőrzés elvei:
  • Kémiai felépítés: megvan-e minden atom, nem szakadt-e a lánc, stb.
  • Sztereokémia: Kötéshosszak, kötésszögek, torziós szögek megfelelnek-e az elvárható (a jó szerkezetek átlagából számított) értékeknek? Nincsenek-e túl közel eső atomok?
  • Fehérjetulajdonságok: Ramachandran-térképen a fi és pszi szögek eloszlása (nincs-e valami a tiltott zónában, stb.); oldalláncok jó környezetben vannak-e, megfelelően szoros-e a hidrofób mag pakoltsága, stb.
• Többféle program: PROCHECK, WHAT_CHECK
• PROCHECK kimenetek pl.:
  
  Ramachandran-plot
  
  Oldallánc-paraméterek
  
  Geometriai torzulások

Másodlagos szerkezet

A meglévő atomi térszerkezet alapján hogyan definiáljuk a benne lévő másodlagos szerkezeti elemeket?

• Másodlagos szerk. definiálható a fi, pszi szögek alapján is, de ez nem megbízható
• Bevált: a hidrogénkötési mintázat alapján (pl. hélixek: i-->i+4 H-kötések, stb.)
• Standard módszer: DSSP program (és adatbázis). Példa
• Kódok: H: Hélix, E: Béta-szál, B: izolált H-kötés, S: görbület, G: 3-10 hélix, stb.

Szerkezeti motívumok

PROMOTIF program és adatbázis.

Főlánc H-kötései

Hélixek

Béta turnök

Kölcsönhatás ligandumokkal

Vizualizálható: LIGPLOT

H-kötéseket és hidrofób felszíneket mutatja

Töltésviszonyok

• Poisson-Boltzmann módszerrel számítható az elektrosztatikus potenciál a fehérje felszínén és környezetében: DELPHI program. Megjelenítés: GRASP program (nem ingyenesek).
  
  acetilkolin-észteráz

  Szubsztrát közelében a fókuszáló hatás, stb. leírható.

Felszínek, üregek

• A felszín meghatározása: Vízmolekula (1,4 angström sugarú gömbbel modellezve) végiggördítése a felszínen
  

  Hozzáférhető felszín: a vízmolekula közepe által leírt felszín
  Molekuláris felszín: a vízmolekula felülete által leírt felszín

• Standard program: Molecular Surface Package (Connolly) (nem ingyenes; számos ingyenes program van, amelyek rosszabbak)
  

  Az apoláros, pozitív, és negatív töltésű felszínrészek más-más színnel jelölve

  

  Kék színnel jelöltük a fehérje belsejében lévő üregeket.