4. Többszörös szekvencia-összerendezés és filogenetikai analízis

Többszörös szekvencia-összerendezés
1. Célja
2. Definíciója
3. Szimultán módszerek
4. Manuális módszerek
5. Progresszív módszerek
6. Clustal és MultAlin
7. Többszörös összerendezések adatbázisai
8. PSI-BLAST
9. Prezentációs programok
Filogenetikai analízis
1. Általános megjegyzések
2. Lépései
3. Programok

Többszörös szekvencia-összerendezés

Célja

Lehetővé tenni egy-egy géncsaládon vagy fehérjecsaládon belül az összefüggések felismerését és a családra jellemző, konzerválódott, biológiailag jelentőséggel bíró mintázatok feltárását. Növeli a jel/zaj viszonyt a páronkénti összerendezéshez képest.

A többszörös szekvencia-összerendezés definíciója

Kétdimenziós táblázat, melynek sorai a szekvenciákat tartalmazzák, oszlopai a pozíciókat képviselik. Példa:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
I Y D G G A V - E A L
II Y D G G I L V E A L
III F E G G I L V E A L
IV F D - G I L V Q A V
V Y E G G A V V Q A L
Konsz. y d G G A/I V/L V e A l
Abszolút pozíció: Egy aminosav/nukleotid sorszáma az adott szekvencián belül. Mindig változatlan.
Relatív pozíció: Annak az oszlopnak a sorszáma, amelyben az adott aminosav/nukleotid az összerendezésen belül szerepel. Az összerendezés változtatásával változik.
Konszenzusszekvencia: Rendszerint az összerendezés aljára írt pszeudoszekvencia, amely egy sorban, szimbólumok segítségével összegzi az egyes pozíciók variabilitását. A pszeudoszekvencia matematikai objektumokból (pl. helyettesítési mátrixok) is állhat.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
I	Y	D	G	G	A	V	-	E	A	L
II	Y	D	G	G	I	L	V	E	A	L
III	F	E	G	G	I	L	V	E	A	L
IV	F	D	-	G	I	L	V	Q	A	V
V	Y	E	G	G	A	V	V	Q	A	L
Konsz.	y	d	G	G	A/I	V/L	V	e	A	l

A többszörös szekvencia-összerendezés módszerei

Szimultán módszerek

A páronkénti szekvencia-összerendező algoritmusok (Needleman-Wunsch, Smith-Waterman, stb.) kiterjeszthetők több szekvenciára is. Ez azonban többdimenziós mátrixokat igényel, a számítási idő a szekvenciák számával exponenciálisan nő. Ezért csak kisszámú, rövid szekvencia esetében alkalmazhatóak.

Manuális módszerek

Összerendezés-szerkesztő programok segítségével. Pl. BioEdit, GeneDoc (Windowshoz), SeaView (Unix/Linux, Windows), stb. Egy kép a BioEdit-ről:

A színezés nagy segítséget jelent a konzerválódott motívumok felismerésénél
Bár felvethető, hogy a manuális módszer szubjektív, mindig szükség van az automatikus módszerrel nyert összerendezések utólagos manuális igazítására.

Progresszív módszerek

Heurisztikus módszerek, melyek ésszerű idő alatt próbálnak jó (ha nem is optimális) összerendezést találni
Pl.:
- Összes lehetséges szekvenciapár összerendezése
- Mindegyik szekvencia összerendezése egy kiválasztott szekvenciával
- A szekvenciák összerendezése tetszőleges sorrendben
- A szekvenciák összerendezése egy filogenetikai törzsfa elágazásainak sorrendje szerint (ez a leggyakoribb)
Elterjedt programok: Clustal, MultAlin

CLUSTAL

Thompson, Higgins & Gibson 1994
Több verzió, legújabb a Clustal W, mely online is elérhető. Grafikus felhasználó felület hozzá: Clustal X
A bemenő szekvenciákon páronkénti összerendezést végez az összes lehetséges módon
A páronkénti összerendezésekből távolságokat számít a szekvenciapárok között
A távolságok alapján filogenetikai törzsfát készít, ez a vezérfa.
A többszörös összerendezést a törzsfa elágazásainak sorrendje szerint végzi: előbb a legközelebbi szekvenciákat rendezi össze, majd hozzárendezi az egyre távolabbiakat
Legújabb verzió különlegességei:
- Súlyozás: az összerendezés pontszámának kiszámításakor a közeli szekvenciákat kisebb súllyal veszi figyelembe (a közel azonos szekvenciák ne nyomják el a távolabbiakat)
- Az aminosav-helyettesítési mátrixokat változtatja az éppen összerendezett szekvenciák távolsága szerint
- Oldallánc- és pozícióspecifikus gap penalty-k

Összerendezés CLUSTAL-lal:

 CLUSTAL W (1.60) multiple sequence alignment
 
 
 hum-U1A         ------MAVPETRPNHTIYINNLNEKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVSRSLKMRGQ 
 mse-U1A         MATIATMPVPETRANHTIYINNLNEKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVSRIMKMRGQ
 xla-U1A         ------MSIQEVRPNNTIYINNLNEKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVSRNLKMRGQ
 dme-U1A         ---------MEMLPNQTIYINNLNEKIKKEELKKSLYAIFSQFGQILDIVALKTLKMRGQ
                           *   * *************.*******************.  . .*****
 
 hum-U1A         AFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDSDIIAKMKGTFVERDRKR-EKRKP
 mse-U1A         AFVIFKEVTSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDSDIIAKMKGTYVERDRKR-EKRKP
 xla-U1A         AFVIFKETSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYSKTDSDIIAKMKGTFVERDRKRQEKRKV
 dme-U1A         AFVIFKEIGSASNALRTMQGFPFYDKPMQIAYSKSDSDIVAKIKGTFKERPKKVKPPKPA
                 *******  **.****.***********.* *.*.****.**.***. **       .
 
 hum-U1A         KSQETPATKKAVQGGGATPVVGAVQGPVPGMPPMTQAPRIMHHMPGQPPYMPPPGMIPPP
 mse-U1A         KSQETPAAKKAVQGGAAAPVVGAVQ-PVPGMPPMPQAPRIMHHMPGQPPYMPPPGMIPPP
 xla-U1A         KVPEVQGVKNAMPGAALLPGVPGQMAAMQDMPGMTQAPRMMH-MAGQAPYMHHPGMMPPP
 dme-U1A         PGTDEKKDKKKK-----------------------------------------------P
                    .    *                                                  *
 
 hum-U1A         GLAPGQIPPGAMPPQQLMPGQMPPAQPLSENPPNHILFLTNLPEETNELMLSMLFNQFPG
 mse-U1A         GLAPGQIPPGAMPPQQLMPGQMPPAQPLSENPPNHILFLTNLPEETNELMLSMLFNQFPG
 xla-U1A         GMAPGQMPPGGMPHGQLMPGQMAPMQPISENPPNHILFLTNLPEETNELMLSMLFNQFPG
 dme-U1A         SSAENSNP-----------------NAQTEQPPNQILFLTNLPEETNEMMLSMLFNQFPG
                   * .  *                 .  .*.***.*************.***********
 
 hum-U1A         FKEVRLVPGRHDIAFVEFDNEVQAGAARDALQGFKITQNNAMKISFAKK
 mse-U1A         FKEVRLVPGRHDIAFVEFDNEVQAGAARDALQGFKITQNNAMKISFAKK
 xla-U1A         FKEVRLVPGRHDIAFVEFDNEVQAGAARESLQGFKITQSNSMKISFAKK
 dme-U1A         FKEVRLVPNRHDIAFVEFTTELQSNAAKEALQGFKITPTHAMKITFAKK
                 ********.********* .*.*..**...*******  ..***.****

MultAlin

Corpet 1988, online elérhető.
Clustal-megközelítés problémája: a kezdeti, páronkénti, tökéletlen összerendezésekből származtatja a vezérfát. A valódi fát a végső összerendezésből lehetne megkapni.
MultAlin: Rekurzív eljárás: a kapott többszörös összerendezésből újraszámolja a vezérfát, ennek alapján újabb összerendezést készít, ezt addig ismétli, míg már nem javul tovább a pontszám.
Hátrány: kezdeti hibák a rekurzió során továbbadódnak

Összerendezés MultAlin-nal:

 Multalin version 5.4.1
 Copyright I.N.R.A. France 1989, 1991, 1994, 1996
 Published research using this software should cite
 Multiple sequence alignment with hierarchical clustering
 F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 10881-10890
 Symbol comparison table: blosum62
 Gap weight: 12
 Gap length weight: 2
 Consensus levels: high=90% low=50%
 Consensus symbols:
  ! is anyone of IV
  $ is anyone of LM
  % is anyone of FY
  # is anyone of NDQEBZ
 
  MSF:    289    Check:   0         ..
  Name: hum-U1A        Len:   289  Check: 9991  Weight:  0.67
  Name: mse-U1A        Len:   289  Check: 9174  Weight:  0.67
  Name: xla-U1A        Len:   289  Check: 7674  Weight:  0.67
  Name: dme-U1A        Len:   289  Check: 3145  Weight:  1.99
  Name: Consensus      Len:   289  Check:  255  Weight:  0.00
 
 //
 
                       1                                                   50 
              hum-U1A  ......MAVP ETRPNHTIYI NNLNEKIKKD ELKKSLYAIF SQFGQILDIL
              mse-U1A  MATIATMPVP ETRANHTIYI NNLNEKIKKD ELKKSLYAIF SQFGQILDIL
              xla-U1A  ......MSIQ EVRPNNTIYI NNLNEKIKKD ELKKSLYAIF SQFGQILDIL
              dme-U1A  .........M EMLPNQTIYI NNLNEKIKKE ELKKSLYAIF SQFGQILDIV
            Consensus  ......m... E.rpN.TIYI NNLNEKIKK# ELKKSLYAIF SQFGQILDIl
 
                       51                                                 100
              hum-U1A  VSRSLKMRGQ AFVIFKEVSS ATNALRSMQG FPFYDKPMRI QYAKTDSDII
              mse-U1A  VSRIMKMRGQ AFVIFKEVTS ATNALRSMQG FPFYDKPMRI QYAKTDSDII
              xla-U1A  VSRNLKMRGQ AFVIFKETSS ATNALRSMQG FPFYDKPMRI QYSKTDSDII
              dme-U1A  ALKTLKMRGQ AFVIFKEIGS ASNALRTMQG FPFYDKPMQI AYSKSDSDIV
            Consensus  vsr.$KMRGQ AFVIFKE..S AtNALRsMQG FPFYDKPMrI qYsKtDSDI!
 
                       101                                                150
              hum-U1A  AKMKGTFVER DRKR.EKRKP KSQETPATKK AVQGGGATPV VGAVQGPVPG
              mse-U1A  AKMKGTYVER DRKR.EKRKP KSQETPAAKK AVQGGAAAPV VGAVQ.PVPG
              xla-U1A  AKMKGTFVER DRKRQEKRKV KVPEVQGVKN AMPGAALLPG VPGQMAAMQD
              dme-U1A  AKIKGTFKER PKK....... .......... .......... ..........
            Consensus  AKmKGT%vER drKr.ekrk. k..e....k. a..g....p. v.........
 
                       151                                                200
              hum-U1A  MPPMTQAPRI MHHMPGQPPY MPPPGMIPPP GLAPGQIPPG AMPPQQLMPG
              mse-U1A  MPPMPQAPRI MHHMPGQPPY MPPPGMIPPP GLAPGQIPPG AMPPQQLMPG
              xla-U1A  MPGMTQAPRM MH.MAGQAPY MHHPGMMPPP GMAPGQMPPG GMPHGQLMPG
              dme-U1A  .......... .......... ......VKPP KPAPGTDEKK DKKKKPSSAE
            Consensus  mp.m.qapr. mh.m.gq.py m..pgm.pPP g.APGq.ppg .mp..qlmpg
 
                       201                                                250
              hum-U1A  QMPPAQPLSE NPPNHILFLT NLPEETNELM LSMLFNQFPG FKEVRLVPGR
              mse-U1A  QMPPAQPLSE NPPNHILFLT NLPEETNELM LSMLFNQFPG FKEVRLVPGR
              xla-U1A  QMAPMQPISE NPPNHILFLT NLPEETNELM LSMLFNQFPG FKEVRLVPGR
              dme-U1A  NSNP.NAQTE QPPNQILFLT NLPEETNEMM LSMLFNQFPG FKEVRLVPNR
            Consensus  #m.P.#p.sE #PPNhILFLT NLPEETNE$M LSMLFNQFPG FKEVRLVPgR
 
                       251                                    289
              hum-U1A  HDIAFVEFDN EVQAGAARDA LQGFKITQNN AMKISFAKK
              mse-U1A  HDIAFVEFDN EVQAGAARDA LQGFKITQNN AMKISFAKK
              xla-U1A  HDIAFVEFDN EVQAGAARES LQGFKITQSN SMKISFAKK
              dme-U1A  HDIAFVEFTT ELQSNAAKEA LQGFKITPTH AMKITFAKK
            Consensus  HDIAFVEFdn EvQagAAr#a LQGFKITq.n aMKIsFAKK

A dme-U1A szekvenciát (Drosophila fehérje) a Clustal és a MultAlin másképpen rendezi hozzá a többihez: Clustal két hézagot nyit, MultAlin csak egy hosszút. A MultAlinnál így több az azonosság, de a következtetés az, h. ez egy bizonytalan régió.

Melyik a legjobb módszer? Ezt nem lehet tudni, a helyes az, ha több módszert is alkalmazunk és az eredményekből konszenzust képezünk, manuálisan is igazítva

Többszörös összerendezések adatbázisai

A Weben többféle összerendezés-adatbázis is elérhető. Két példa:

Pfam

Automatikusan származtatott összerendezéseket tartalmaz. Pl.:

 A1AA_HUMAN  SLKYP....AI..MTER.KAA..AILALL.WVV.AL.VVSVGP.LLG...WKEPV..PPDE....RF 
 A1AA_RAT    SLKYP....AI..MTER.KAA..AILALL.WAV.AL.VVSVGP.LLG...WKEPV..PPDE....RF
 A1AB_CANFA  SLQYP....TL..VTRR.KAI..LALLGV.WVL.ST.VISIGP.LLG...WKEPA..PNDD....KE
 A1AB_HUMAN  SLQYP....TL..VTRR.KAI..LALLSV.WVL.ST.VISIGP.LLG...WKEPA..PNDD....KE
 A1AB_MESAU  SLQYP....TL..VTRR.KAI..LALLSV.WVL.ST.VISIGP.LLG...WKEPA..PNDD....KE
 A1AB_RAT    SLQYP....TL..VTRR.KAI..LALLSV.WVL.ST.VISIGP.LLG...WKEPA..PNDD....KE
 A1AC_BOVIN  PLRYP....TI..VTQK.RGL..MALLCV.WAL.SL.VISIGP.LFG...WRQPA..PEDE.....T
 A1AC_HUMAN  PLRYP....TI..VTQR.RGL..MALLCV.WAL.SL.VISIGP.LFG...WRQPA..PEDE.....T
 A1AC_RAT    PLRYP....TI..VTQR.RGV..RALLCV.WVL.SL.VISIGP.LFG...WRQPA..PEDE.....T
 OAR_DROME   PINYA....QK..RTVG.RVL..LLISGV.WLL.SL.LISSPP.LIG...W.NDW..PDEFT..SAT
 D1DR_CARAU  PFRYE....RK..MTPR.VAF..VMISGA.WTL.SV.LISFIPVQLK...WHKAQ..PIGFL..EVN
 D1DR_FUGRU  PFRYE....RK..MTPK.VAC..LMISVA.WTL.SV.LISFIPVQLN...WHKAQ..TASYVELNGT
 DADR_DIDMA  PFRYE....RK..MTPK.AAF..ILISVA.WTL.SV.LISFIPVQLN...WHKARPLSSPDG..NVS
 ...

 A1AA_HUMAN  ...............CGI..TE......................EAG...YA.....VF......SS
 A1AA_RAT    ...............CGI..TE......................EVG...YA.....IF......SS
 A1AB_CANFA  ...............CGV..TE......................EPF...YA.....LF......SS
 A1AB_HUMAN  ...............CGV..TE......................EPF...YA.....LF......SS
 A1AB_MESAU  ...............CGV..TE......................EPF...YA.....LF......SS
 A1AB_RAT    ...............CGV..TE......................EPF...YA.....LF......SS
 A1AC_BOVIN  ..............ICQI..NE......................EPG...YV.....LF......SA
 A1AC_HUMAN  ..............ICQI..NE......................EPG...YV.....LF......SA
 A1AC_RAT    ..............ICQI..NE......................EPG...YV.....LF......SA
 OAR_DROME   ..............PCEL..TS......................QRG...YV.....IY......SS
 D1DR_CARAU  ..............ASRR...DLPTDNC........DSSL....NRT...YA.....IS......SS
 D1DR_FUGRU  ..............YAGD..LPPDNCD..........SSL....NRT...YA.....IS......SS
 DADR_DIDMA  ..............SQDE...TMDNCD..........SSL....SRT...YA.....IS......SS
 ...

 A1AA_HUMAN  V.CSFY...LPMAVIV.VMY.CRV.YVV....ARS..TTRSLEA.GVKR
 A1AA_RAT    V.CSFY...LPMAVIV.VMY.CRV.YVV....ARS..TTRSL.....EA
 A1AB_CANFA  L.GSFY...IPLAVIL.VMY.CRV.YIV....AKR..TTKNL.....EA
 A1AB_HUMAN  L.GSFY...IPLAVIL.VMY.CRV.YIV....AKR..TTKNL.....EA
 A1AB_MESAU  L.GSFY...IPLAVIL.VMY.CRV.YIV....AKR..TTKNL.....EA
 A1AB_RAT    L.GSFY...IPLAVIL.VMY.CRV.YIV....AKR..TTKNL.....EA
 A1AC_BOVIN  L.GSFY...VPLTIIL.VMY.CRV.YVV....AKR..ESRGLKS.GLKT
 A1AC_HUMAN  L.GSFY...LPLAIIL.VMY.CRV.YVV....AKR..ESRGLKS.GLKT
 A1AC_RAT    L.GSFY...VPLAIIL.VMY.CRV.YVV....AKR..ESRGLKS.GLKT
 OAR_DROME   L.GSFF...IPLAIMT.IVY.IEI.FVA....TRR..RLRERA..RANK
 D1DR_CARAU  L.ISFY...IPVAIMI.VTY.TQI.YRI....AQK..QIRRIS..ALER
 D1DR_FUGRU  L.ISFY...IPVAIMI.VTY.TRI.YRI....AQK..QIRRIS..ALER
 DADR_DIDMA  L.ISFY...IPVAIMI.VTY.TRI.YRI....AQK..QIRRIS..ALER

597 darab G-fehérjéhez kapcsolt receptor szekvenciájának összerendezése (részlet!) a Pfam adatbázisból

Sok szekvencia, erős divergenciákkal, ezért sok az inzerció/deléció. Az automatikus módszer ezeket nehezen kezeli, ezért túlságosan sok hézagot szúr be --> sok az elszigetelt, "elárvult" aminosavrész. Ez szétforgácsolja és elnyújtja az összerendezést, biológiai jelentése nincs.

PRINTS

Manuálisan származtatott összerendezéseket tartalmaz. Pl.:


OAR_DROME  PINYAQ...KRTVGRVLLLISGVWLLSLLISSP.PLIG.WND.....WPDEFTSATP...
D2DR_RAT   PMLYNTR..YSSKRRVTVMIAIVWVLSFTISCP.LLFG.LNN...T.DQNE.........
D3DR_RAT   PVHYQHGTGQSSCRRVALMITAVWVLAFAVSCP.LLFG.FNT...TGDPSI.........
DADR_RAT   PFQYER...KMTPKAAFILISVAWTLSVLISFI.PVQLSWHKAK.PTWPLDGNFTSLEDT
DBDR_RAT   PFRYER...KMTQRVALVMVGLAWTLSILISFI.PVQLNWHRDKAGSQGQEGLLSNGTPW
A1AB_RAT   SLQYPT...LVTRRKAILALLSVWVLSTVISIG.PLLG.WKE......PAPNDDKE....
B1AR_RAT   PFRYQS...LLTRARARALVCTVWAISALVSFL.PILMHWW.....RAESD.EARRCYND
B2AR_HUMAN PFKYQS...LLTKNKARVIILMVWIVSGLTSFL.PIQMHWY.....RATHQ.EAINCYAN
B2AR_RAT   PFKYQS...LLTKNKARVVILMVWIVSGLTSFL.PIQMHWY.....RATHK.QAIDCYAK
B3AR_RAT   PLRYGT...LVTKRRARAAVVLVWIVSATVSFA.PIMSQWW.....RVGADAEAQECHSN
5HTA_RAT   PIDYVN...KRTPRRAAALISLTWLIGFLISIP.PMLG.WRTPEDRSDPDA.........
5HTD_RAT   ALEYSK...RRTAGHAAAMIAAVWAISICISIP.PLF..WRQ..ATAHEEMSD.......
5HT2_RAT   PIHHSR...FNSRTKAFLKIIAVWTISVGISMPIPVFG.LQDDSKVFKEGS.........
...

OAR_DROME  ............CELTSQRG.................YVIYSSLGSPFIPLAIMTIVYIEIFVATRRRLRERARANK
D2DR_RAT   ............CIIANPA..................FVVYSSIVSFYVPFIVTLLVYIKIYIVLRKRRKR......
D3DR_RAT   ............CSISNPD..................FVIYSSVVSFYVPFGVTVLVYARIYIVLRQRQRK......
DADR_RAT   ED........DNCDTRLSRT.................YAISSSLISFYIPVAIMIVTYTSIYRIAQKQIRR......
DBDR_RAT   EEGWELEGRTENCDSSLNRT.................YAISSSLISFYIPVAIMIVTYTRIYRIAQVQIRR......
A1AB_RAT   ............CGVTEEPF.................CALFCSLGSFYIPLAVILVMYCRVYIVAKRTTKN......
B1AR_RAT   PK..........CCDFVTNRA................YAIASSVVSFYVPLCIMAFVYLRVFREAQKQVKK......
B2AR_HUMAN ET..........CCDFFTNQA................YAIASSIVSFYVPLVIMVFVYSRVFQEAKRQLQK......
B2AR_RAT   ET..........CCDFFTNQA................YAIASSIVSFYVPLVVMVFVYSRVFQVAKRQLQK......
B3AR_RAT   PR..........CCSFASNMP................YALLSSSVSFYLPLLVMLFVYARVFVVAKRQRRF......
5HTA_RAT   ............CTISKDHG.................YTIYSTFGAFYIPLLLMLVLYGRIFRAARFRIRK......
5HTD_RAT   ............CLVNTSQIS................YTIYSTCGAFYIPSILLIILYGRIYVAARSRILN......
5HT2_RAT   ............CLLADDN..................FVLIGSFVAFFIPLTIMVITYFLTIKSLQKEATL......
...

687 G-fehérjéhez kapcsolt receptor szekvenciájának összerendezése (részlet!) a PRINTS adatbázisból

Itt a hézagok beszúrásával óvatosak voltak, így felismerhető két konzerválódott domén. Ez is mutatja, mennyire fontos a manuális szerkesztés.

PSI-BLAST

Position Specific Iterated Basic Local Alignment Search Tool: a BLAST összerendezés-kereső program kiterjesztése:
- Előbb egy hagyományos BLAST kereséssel kigyűjti egy szekvencia homológjait, ezekből többszörös összerendezést készít
- A többszörös összerendezésből elkészít egy szekvenciaprofilt
- A szekvenciaprofillal újból keresést végez a szekvenciaadatbázison
- Ezáltal távoli homológokat is megtalál
Hátrány: ha bemászott egy nem homológ szekvencia (fals pozitív találat) a profilba, akkor a keresés további nem homológ szekvenciákat talál

Prezentációs programok

Olvashatóbbá, esztétikusabbá teszik a többszörös összerendezést, sokszor segítenek fontos összefüggések felismerésében, számolnak konszenzust, stb. Némelyik webszerveren keresztül is elérhető.
BoxShade (Unix, Macintosh)
ALSCRIPT (Unix, PC)

Filogenetikai analízis

Általános megjegyzések

A filogenetikai analízis célja az evolúciós viszonyok, az evolúciós történet feltárása. Eredménye általában egy filogenetikai fa (törzsfa). A fák két fő fajtája:

Gyökeres fa

Gyökértelen fa
Az inkorrekt eredmények generálásának nagy a veszélye, mert a múltbeli eseményekről nincs közvetlen információnk, csak következtetni tudunk rájuk
Ezért mindig fenntartásokkal kell kezelni az analízis eredményét. Nem elég egyszerűen lefuttatni egy filogenetikai programot, és kész.
A filogenetikai törzsfákat építő módszerek egy bizonyos evolúciós modell érvényességét feltételezik.
Legfontosabb feltételezés, h. a törzsfejlődés fával ábrázolható. Ez nem mindig igaz, pl. hibrid fajok, ill. (mikro)organizmusok között előforduló DNS-átvitel (laterális géntranszfer) esetén.
További feltételezés: a szekvenciák mind homológok
Inkább DNS-szekvenciák alapján végzik, fehérjeszekvencia alapján ritkábban, nem is eléggé kidolgozott.

A filogenetikai analízis lépései

Négy lépés:

Összerendezés
A helyettesítési (tkp. evolúciós) modell meghatározása
Faépítés
A fa kiértékelése

1. Összerendezés

Az ismertetett módszerekkel
Clustal, Multalin, stb. kezdetleges filogenetikai analízist végez a vezérfa felépítésekor, de ezek nem megbízhatóak!

Clustal vezérfa az 5.8S rDNS szekvenciák alapján. Furcsaságok: vörösmoszatok több törzsben szétszórva szerepelnek, tűlevelűek (conifers) is, a páfrányok (ferns) és mohák viszont összekerültek.

A vezérfát és a biológiai háttértudást felhasználva az összerendezést alkalmassá kell tenni az alaposabb filogenetikai analízisre --> "összerendezés-sebészet". Pl.:

         116
         |
1  ARABI GCGCCC
2  LYCOP .....C
3  triti .....C
4  LACTU .....C
5  SILEN .....C
6  vicia .....C
7  CANEL .....C
8  potam .....C
9  ephed .....C
10 gnetu .-...C
11 PINUS .....C
12 PICEA .....C
13 TAXUS .GC..G
14 marsi .-...C
15 osmun .-...C
16 mnium .....C
17 CHLAM ....TC
18 SPERM ....TC
19 TETRA ....TC
20 CHLOR ....TC
21 CLADO ....TC

       122-144

---CAAGCCTTCT-GGCCG----
---GAAGCCATTT-GGCCG----
---GAGGCCACTC-GGCCG----
---GAAGCCATCC-GGCTG----
---GAAGC--TTC-GGCTG----
---GATGCCATTA-GGTTG----
---GAGGCCACTA-GGCTG----
---TAAGCTTCCG-GGCCG----
---GAAGCC--TC-CGCCA----
TCCG-AGCC--TA-GGCCG----
---GAGGCC--TC-GGTCG----
---GAGNCC--TC-GGTCG----
---GAG-C---TC-GGCCG----
---GAGGC---TC-GTCCG----
---GCGGC---TC-GTCCA----
---GAGGC---TC-GTCCG----
---GAGGC--TTC-GGCCA----
---GAGGC--TTC-GGCCG----
---GAGGC--CTC-GGCCA----
---GAGAC--CTC-GGTCA----
---AAGTC--TAC-GGACT----

        155
          |
AGGGCACGTCT
A..........
A.......C..
A.......C..
A..........
A..........
A....T..C..
A.....A.C..
A..........
A..........
A..........
A..........
A..........
A..........
A.....T.C..
A.....TT..C
A.A...T....
A.A...T..T.
A.A.....C..
A.A...T....
T.A...T....

22 HETER .....C
23 VOLVA ....TC
24 SCLER .....C
25 sacch .....C
26 BIPOL .....C
27 GLOMU ....TC

TTT--GGT-ATT----CCGA---
TTT--GGCCATT----CCGA---
CTT--GGT-ATT----CCGG---
CTT--GGT-ATT----CCAG---
TTT--GGT-ATT----CCAA---
CCT--GGT-ATT----CCGG---

A..-....C..
A.A...T.C..
G.....T.C..
G.....T.C..
A.....T.C..
G.A.T.T.C..

28 CYANI ....TT
29 SARCO ....TC
30 PHYTO ..A.TT
31 SCYTO ...-TT
32 crypt .---CT
33 PRORO ....TT

TC--AGGAGAATTTTATTTTCCT
GC---GGTAA-TC--------CT
CCG--GGTTAGTC---CTG----
CCG--GGTTAGTC---CTG----
CC---AGC--TGA---CT-----
TCG--GGATATCC---CTG----

G.A........
GCA.--T....
G.A.T.T.C..
G.A...T.CT.
------T...A
AA....T.C..

Kiinduló összerendezés, a szekvenciák az organizmusok rendszertani hovatartozása szerinti sorrendben vannak. A középső részben lévő szekvenciák három csoportra különülnek el (zöld növények, gombák, egysejtűek), s kevéssé hasonlítanak, összerendezésük önkényes. (A pontok itt az oszlop tetején jelölttel azonos bázist jelentenek.)

Ebből állítjuk elő "sebészkedés" révén a filogenetikai analízisre előkészített összerendezést:

         116
         |
1  ARABI GCGCCC
2  LYCOP GCGCCC
3  triti GCGCCC
4  LACTU GCGCCC
5  SILEN GCGCCC
6  vicia GCGCCC
7  CANEL GCGCCC
8  potam GCGCCC
9  ephed G-GCCC
10 gnetu G-GCCC
11 PINUS GCGCCC
12 PICEA GCGCCC
13 TAXUS GGCCCG
14 marsi G-GCCC
15 osmun G-GCCC
16 mnium GCGCCC
17 CHLAM GCGCTC
18 SPERM GCGCTC
19 TETRA GCGCTC
20 CHLOR GCGCTC
21 CLADO GCGCTC

       122-144

???CAAGCCTTCT?GGCCG????
???GAAGCCATTT?GGCCG????
???GAGGCCACTC?GGCCG????
???GAAGCCATCC?GGCTG????
???GAAGC?-TTC?GGCTG????
???GATGCCATTA?GGTTG????
???GAGGCCACTA?GGCTG????
???TAAGCTTCCG?GGCCG????
???GAAGCC?-TC?CGCCA????
TCCG?AGCC?-TA?GGCCG????
???GAGGCC?-TC?GGTCG????
???GAG?CC?-TC?GGTCG????
???GAG-C?-?TC?GGCCG????
???GAGGC??-TC?GTCCG????
???GCGGC??-TC?GTCCA????
???GAGGC??-TC?GTCCG????
???GAGGC?-TTC?GGCCA????
???GAGGC?-TTC?GGCCG????
???GAGGC?-CTC?GGCCA????
???GAGAC?-CTC?GGTCA????
???AAGTC?-TAC?GGACT????

        155
          |
AGGGCACGTCT
AGGGCACGTCT
AGGGCACGCCT
AGGGCACGCCT
AGGGCACGTCT
AGGGCACGTCT
AGGGCTCGCCT
AGGGCAAGCCT
AGGGCACGTCT
AGGGCACGTCT
AGGGCACGTCT
AGGGCACGTCT
AGGGCACGTCT
AGGGCACGTCT
AGGGCATGCCT
AGGGCATTTCC
AGAGCATGTCT
AGAGCATGTTT
AGAGCACGCCT
AGAGCATGTCT
TGAGCATGTCT

[    122'-141'     ]

????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????

22 HETER GCGCCC
23 VOLVA GCGCTC
24 SCLER GCGCCC
25 sacch GCGCCC
26 BIPOL GCGCCC
27 GLOMU GCGCTC

???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????

AGG-CACGCCT
AGAGCATGCCT
GGGGCATGCCT
GGGGCATGCCT
AGGGCATGCCT
GGAGTATGCCT

TTT??GGT-ATT????CCGA
TTT??GGCCATT????CCGA
CTT??GGT-ATT????CCGG
CTT??GGT-ATT????CCAG
TTT??GGT-ATT????CCAA
CCT??GGT-ATT????CCGG

28 CYANI GCGCTT
29 SARCO GCGCTC
30 PHYTO GCACCT
31 SCYTO GCG-TT
32 crypt G??-CT
33 PRORO GCGCTT

???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????
???????????????????????

GGAGCACGTCT
GCAG-?TGTCT
GGAGTATGCCT
GGAGCATGCTT
??????TGTCA
AAGGCATGCCT

????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????
????????????????????

A filogenetikai elemzéshez előkészített összerendezés.

Ez az összerendezés a következő módosítások által keletkezett a kiinduló összerendezésből:

A gombáknál és az egysejtűeknél a középső szekvenciadarabot kivágtuk és ?-ekkel (jelentése: hiányzó nukleotid) helyettesítettük, mert a zöld növényekhez való rendezésük önkényes volt.
A gombák kivágott szakaszát a szekvencia végére illesztettük, mert egymás közti variációik fontosak. (A szekvencia épsége a filogenetikai elemzésnél nem szükséges.) Az egysejtűek kivágott szakaszát elhagytuk, nem hordoz filogenetikailag értékes információt.
Az egy nukleotidnál hosszabb hézagokat egy hézagra és megfelelő számú ?-re cseréltük (a hosszabb hézagot nem helyes egymástól független deléciók egymásutánjának tekinteni).

A helyettesítési (evolúciós) modell meghatározása

Három eleme (paramétere) van:

Bázisgyakoriságok
A bázisok egymás közti cseréjének gyakorisága
A szekvencián belüli pozíciók mutációgyakoriságának heterogenitása

Ezek meghatározásának két módja:

Empirikus módszer: korábbi elemzésekből meghatározott értékeket használunk fel, mint fix értékeket. Előny: könnyű számíthatóság. Hátrány: az adott adathalmazra nem biztos, hogy jók a paraméterek.
Paraméteres módszer: magából a vizsgált adathalmazból vezetjük le a paramétereket. Előny: pontosabb lehet. Hátrány: félrevezethet, ha az adatkészlet nem megfelelő.

A bázisok egymás közti cseréjének gyakorisága

Lehet előre rögzített mátrix pl.:
```
                         A C G T
		       A - 2 1 2
		       C 2 - 2 1
		       G 1 2 - 2
		       T 2 1 2 -
```
A pontszámok a csere költségét mutatják, purinbázis pirimidinbázisra való cseréje (transzverzió) ritkább, ezért költségesebb, mint a purin-purin és a pirimidin-pirimidin csere (tranzíció).
Dolgozhatunk az összerendezésből számított helyettesítési mátrixokkal is
Időreverzibilis mátrixok: az oda- és visszacsere pontszáma azonos, akkor teljesül, ha nincs meghatározott időbeli eltolódás a bázisfrekvenciákban (stacionárius modell). Létezik egy korrekciós módszer nemstacionárius esetre.

A szekvencián belüli pozíciók mutációgyakoriságának heterogenitása

A szekvencián belül a mutációk gyakorisága erősen variábilis. Pl. fehérjét kódoló szakasznál a kodonok harmadik bázisai sokkal variábilisabbak, mint az első kettő. A fehérjék konzerválódott régióit kódoló részek is kevésbé variábilisek.
Modellek a mutációgyakoriság heterogenitásának leírására:
1. Nemparaméteres módszer: az egyes pozíciókat (pl. szekvenciaszakaszokat) kategóriákba sorolja a megfigyelt mutációs gyakoriság alapján
2. Invariánsok módszere: A pozíciók egy bizonyos hányadát invariánsnak tekinti, a többit azonos valószínűséggel változónak
3. Gamma eloszlás módszere (legkorszerűbb): feltételezi, h. a mutációs gyakoriságok eloszlása a gamma valószínűségeloszlás szerinti, ennek az alakját egy paraméter jellemzi, melyet meg kell becsülni. Lehet folytonos vagy diszkrét.
  
  Gamma eloszlás. Bal oldalon a valószínűségeloszlás sűrűségfüggvénye, jobb oldalon az eloszlásfüggvény, mindkettő a két paraméter (alfa, théta) több lehetséges értéke mellett.

Melyik helyettesítési modellt válasszuk? A kevés paraméterrel dolgozó modellek jobban alkalmazhatóbbak, megbízhatóbbak, a túlságosan leegyszerűsített modellek viszont hibás eredményt adhatnak. Fontos a tranzíciós és a transzverzió megkülönböztetése és a mutációgyakoriság heterogenitásának figyelembe vétele. Gondosan kell kiválasztani az adott adatokhoz legjobban illeszkedő evolúciós modellt.

A fa felépítése

A faépítő módszerek kétféle osztályozása:

- Algoritmus alapú: egy algoritmus levezet egy bizonyos fát
- Kritérium alapú: az összes lehetséges fát generálja, ezeket értékeli valamilyen optimalizációs kritérium alapján.
- Távolság alapú: Páronkénti távolságokat számít a szekvenciák között, majd ezekkel a távolságokkal dolgozik tovább, fákat levezetve belőlük. A távolságszámításnál mindig információvesztés van.
- Karakter alapú: (Karakter = pozíció az összerendezésben.) Olyan fákat származtat le, amelyek mindegyik pozícióra optimalizálják az adatmintázatok eloszlását.

Távolság alapú módszerek

A szekvenciák közötti távolság egy határértéket ér el, ahogy a távolság nő. Ha egy pozícióban már történt mutáció, a további mutációk már nem teszik távolibbá. A távolság alapú módszerek korrigálnak erre az effektusra.
Neighbor Joining (NJ): Egy csillag alakú fából kiindulva a legközelebbi szomszédokat összekapcsolja, helyettesíti őket az átlagukkal, majd ezt ismételgeti a teljes fa kialakulásáig.
Minimum Evolution (ME): A legrövidebb olyan fát találja meg, amely összeegyeztethető a szekvenciák közötti távolságokkal. (A faágak hossza evolúciós távolságnak felel meg, így két szekvencia távolsága a fa szerint számítható a megfelelő ágak hosszának összeadásával.) Hasonló elven működik a Fitch-Margoliash (FM) módszer.

Karakter alapú módszerek

Maximum Parsimony (MP): "legnagyobb takarékosság" módszere: Olyan fát épít, ami a lehető legkevesebb mutációs eseménnyel magyarázza meg a meglévő szekvenciák létrejöttét. Számos azonos pontszámú fát szolgáltat, ezek közös részét vehetjük mint megbízhatót. Nagy távolságú szekvenciák esetében hátránya, h. azonos bázis esetén azt tételezi fel, h. nem történt mutáció, holott valószínűbb a visszacserélődés.
Maximum Likelihood (ML): "legnagyobb valószínűség" módszere: Komplikált módszer. Minden pozícióra kiszámítja, hogy adott fa és helyettesítési modell mellett mi a valószínűsége annak, hogy a megfigyelt variációs mintázat jöjjön létre az adott pozícióban. Az egyes pozíciókra kapott valószínűségek összeszorzásával adódik a teljes fa valószínűsége. Ezt sok fára a legjobbat kiválasztja. Ezt többféle helyettesítési modell mellett is elvégezhetjük, ezek közül is kiválasztva a legjobbat. Igen számításigényes, de ez a legmegbízhatóbb.

A fák kiértékelése

Kétféle módszer:

Randomizált adatokra kapott eredményekkel való összehasonlítás
A kapott fa alátámasztottságának tesztelése ún. "resampling" statisztikai módszerekkel (bootstrapping, jackknife). Lényegük: a meglévő adatokból véletlenszerűen mintákat veszünk, ezekre végezzük el a számítást, majd statisztikát készítünk. (Nem részletezzük.)

Filogenetikai szoftver

PHYLIP (Philogeny Inference Package): Ingyenes csomag, kb. 30 programmal, melyek a filogenetikai analízis mindenféle részkérdésére megoldást kínálnak. Parancssorral vezérelhető (nem grafikus).
PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony): Megvásárolható program (kb. $100). Grafikus felhasználói felületű, menüvezérelt (de csak Macintoshon, más rendszereken parancssorvezérelt). A legkülönfélébb eljárások széles választékát kínálja.