6. Nukleotidszekvenciák analízise

Bevezetés

Centrális dogma

Rövidítések: UTR: Untranslated Region, CDS: Coding sequence

A genetikai kód

A genetikai kód közel univerzális (apróbb eltérések azért vannak egyes mikroorganizmusokban, mitokondriumokban, stb.)

A TGA időnként nem Stop-ot, hanem szelenociszteint (Sec) kódol (21. aminosav!)

DNS-szekvenciák összeszerelése

• cDNS szekvenálásánál 200-500 bázis hosszú darabokat kapunk (egy menetben ekkorát lehet szekvenálni, újabban azért max. 1000-et is)
• Szekvenálási hibák: kb. 5% (hibás bázisok; kimaradt/tévesen beszúrt bázisok: ún. fantom INDEL-ek)
• Emiatt mindkét szálat többször meg kell szekvenálni a megbízhatóság végett
• A teljes szekvenciát a darabokból kell összeszerelni és konszenzust konstruálni:

  AACCGTTTACGAAACCAGGTGC AACCGTTTACGAAACCAGGTGCGCGCCCGCGGGAAT AACCGTTTACGAACCCAGGTGC (konszenzus:) AACCGTTTACGAAaCCAGGTGCGCGCGCGcGGGAATCCTAAAAA CGCGCGCGCGGGAATCCTAAAAA TGCGCGCGCGAGGGAATCCTAAAAA

  Kisbetűk: kisebb megbízhatóság

  
  
• Összeszerelés: különféle programokkal, pl. TIGR Assembler

Génvadászati forgatókönyv

1. Kiszűrni a repetitív elemeket (kiderül, hol nem lehetnek a szabályozó és kódoló régiók
2. Hasonlósági keresést végezni az ismert szekvenciák adatbázisain
3. Megvizsgálni a kodongyakoriságok eltolódásait (a fehérjekódoló régiók legegyértelműbb jele)
4. Funkcionális helyeket (iniciáció, termináció, exon-intron határok, promoterek, stb.) keresni az ismert szekvenciamintázatok alapján
5. A fenti lépésekből nyert információt egységes képbe foglalni, konszenzusos képet kialakítani

Fontos:

• A legtöbb program specifikus valamely fajra vagy élőlénycsoportra
• A programokat a megfelelő kontextusban kell használni (pl. exon-intron határt ne keressünk cDNS-ben)

A repetitív elemek kiszűrése

• Repetitív elemek: rövid (vagy hosszabb) ismétlődő szekvenciadarabok
• Eukariota genomok jelentős részét teszik ki
• "Interspersed" repeat: a genomban elszórva találhatóak, többnyire transzpozábilis elemek (pl. transzpozonok) inaktiválódott kópiái
• Számos családjuk van, adatbázisuk: RepBase
• Minden DNS-elemzés előtt ki kell szűrni ezeket a szekvenciából, mert minden elemzőprogramot megzavarnának.
• Jelentősége: megmutatja, hol nem lehetnek szabályozó és kódoló régiók
• Programok erre: pl. Censor, RepeatMasker: a RepBase vagy hasonló adatbázis alapján szűrnek
• Pl. Censor futtatás eredménye:

  Bemenő szekvencia: humán kreatin kináz génjének részlete > HUMCKMM1 ggatccttcctccttggcctcccaaagtgctgggattacaggtgtgagccactgcacctg gcctattacccttctcaggctctggagtccatccttctgctctgtctccctcagttcaat tgttttttgttttttgttttttttttagacacagtctcgctctgtcaccaaggctggagt gcagcagtgcgatcacagctcaccgcagcctcacctcccaggctcaagtgatcctcccat ctcggcctctgagtagctgagactataggtgtgtccacatgtccggctaatttttgtatt tttagtagagacagggtttcaccgcgttggccagggtggtcttgaactcctgagctcaag caatcctcctgcctcagcctccttgttttgatttttagatcccacaaataacttgtgatg tttgtctttctatacctggttcatttaacattttctttttcttttcttttcttttttttt ttttttgtgagactgagtcttgctctgtcactcaggctggagggcaatggtgcatctcag ctcactgcaacctccacctcctaggttcaagcaattcttatgcctcagcctcctggctag ctgggattacaggcgtgtgtcaccatgccaggctaatttttgtacttttagtagagatgg ggtttcaccatgttggccaggctggtcttgaactcctggcctcaagtgatccacccgcct ccgcctctgcctcccaaagtgctgggattacgggcctgagccactgtgcccggcccatct aacattttcactgtcaatcacaatgggattaaaactcctcccacagcccctagggacca CENSOR futtatás eredménye: Megtalált repetitív elemek: kezdet vég elem neve humckmm1 2 63 Alu-Jb 1 62 c humckmm1 67 119 L1MA2 697 751 c humckmm1 138 382 Alu-Jb 42 290 c humckmm1 383 449 L1MA2 623 696 c humckmm1 451 480 (TTTTC) 5 33 d humckmm1 481 775 Alu-Sz 1 290 c A repetitív elemektől megtisztított szekvencia (a törölt részek kiikszelve): GXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTATXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTGTTTTTTGTTTTTTGTXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXCATCTAACATTTTCACTGTCAATCACAATGGGATTAAAACTCCTCCCACAGCCCCTAGGGACCA

Hasonlósági keresések

A génazonosítás legjobb módszere, ha találunk a szekvenciaadatbázisokban már meglévő, hasonló szekvenciát. Ennek módjai:

• A szekvencia összehasonlítása a GenBank-kal, ill. a dbEST-vel (BLASTN)
• A szekvencia mind a 6 lehetséges konceptuális transzlációjának összehasonlítása a fehérjeszekvencia-adatbázisokkal (BLASTX)
• A szekvencia transzlációinak összehasonlítása a GenBank transzlált változatával (TBLASTX)
• A szekvencia transzlációinak összehasonlítása másodlagos fehérjeszekvencia-adatbázissal (pl. PROSITE)

Csapdák:

• Esetenként benne maradhat az mRNS-ben, így a cDNS-ben egy intron. Ekkor ezt tévesen exonnak vélhetjük.
• A fehérjeszekvencia-adatbázisban nem valódi fehérjeszekvenciák is lehetnek (szintén transzlációk)
• Az új szekvenciáknak csak kb. a fele mutat hasonlóságot valamilyen régebbi szekvenciával
• Stb.

ORF-detektálás

• ORF: Open Reading Frame ("nyitott leolvasási keret"): olyan nukleotidszekvencia-szakasz, melyet Stop kodon zár le.
• Melyik a valódi leolvasási keret? Ehhez előállítjuk mind a 6 lehetséges transzlációt (a DNS mindkét szála leolvasható, egymással ellentétes irányban, és mindkét szál háromféleképpen olvasható le), pl.
  
  

  Your Nucleic Acid Sequence: 10 20 30 40 50 0 TCCATTGAGC CTTATACCAG TAACATCTAC ACTCGAAGAT CTTGTCAGGG 50 GAATTTCAGA TTGTGAATCC TCACTTACTG AAAGATCTTA CTGAGCGGGG 100 CTTGTGGAAT GAAGAGATGA AAAATCAGAT TATTGCATGC AATGGCTCCA 150 TTCAGTTTTC CTTTTTCAGA GCATACCAGA AATTCCTGAT GACCTGAAGC 200 AACTCTATAA GACCGTGTGG GAAATCTCTC AGAAGACTGT TCTCAAGATG Six-Frame Amino Acid Translation: Forward 0: 10 20 30 40 50 0 SIEPYTSNIY TRRSCQGNFR L!ILTY!KIL LSGACGMKR! KIRLLHAMAP 50 FSFPFSEHTR NS!!PEATL! DRVGNLSEDC SQD Forward 1: 10 20 30 40 50 0 PLSLIPVTST LEDLVRGISD CESSLTERSY !AGLVE!RDE KSDYCMQWLH 50 SVFLFQSIPE IPDDLKQLYK TVWEISQKTV LKM Forward 2: 10 20 30 40 50 0 H!ALYQ!HLH SKILSGEFQI VNPHLLKDLT ERGLWNEEMK NQIIACNGSI 50 QFSFFRAYQK FLMT!SNSIR PCGKSLRRLF SR Reverse 0: 10 20 30 40 50 0 HLENSLLRDF PHGLIELLQV IRNFWYALKK EN!MEPLHAI I!FFISSFHK 50 PRSVRSFSK! GFTI!NSPDK IFECRCYWYK AQW Reverse 1: 10 20 30 40 50 0 ILRTVF!EIS HTVL!SCFRS SGISGML!KR KTEWSHCMQ! SDFSSLHSTS 50 PAQ!DLSVSE DSQSEIPLTR SSSVDVTGIR LNG Reverse 2: 10 20 30 40 50 0 S!EQSSERFP TRSYRVASGH QEFLVCSEKG KLNGAIACNN LIFHLFIPQA 50 PLSKIFQ!VR IHNLKFP!QD LRV!MLLV!G SM

• A valódi leolvasási keret valószínűleg a leghosszabb megszakítatlan szekvenciát eredményező.
• A Start kodon azonosítása sokkal nehezebb (ATG a metionin kódja is), ld. később.

Kodongyakoriság-eltolódások detektálása

• A nemkódoló és a kódoló régiókban az egyes kodonok (nukleotidhármasok) gyakorisága jellegzetesen eltérő
• Különféle organizmusok más-más kodonpreferenciát mutatnak. Pl. a szerin hatféle kodonjának gyakoriságai 5 fajban:

  Kodon	E. coli	D. melanogaster	H. sapiens	Z. mays	S. cerevisiae
  AGT	3	1	10	3	5
  AGC	20	23	34	30	4
  TCG	4	17	9	22	1
  TCA	2	2	5	4	6
  TCT	34	9	13	4	52
  TCC	37	48	28	37	33

• Organizmuson belül is változhat! Pl. E. coli-nál három kategória
• Sokféleképpen meg lehet ragadni, legsikeresebb: a hexamerek (nukleotidhatosok) előfordulási gyakorisága
• Pl. GeneMark program valószínűséget számol (kódoló-e a régió) a hexamergyakoriságok alapján, mind a 6 leolvasási keretben.
  
• Más programok (pl. GenScan) Markov-modellekkel dolgoznak:
  

  Pozíciófüggő (inhomogén) ötödrendű Markov-modell: minden pozícióban valamely nukleotid valószínűségét az előtte levő öt nukleotid milyensége határozza meg, s ez a kerethez viszonyított pozíciótól is függ. A valószínűségértékeket a már ismert gének alapján határozzák meg, új szekvencia valószínűsége a modell alapján kiértékelhető.

Funkcionális helyek detektálása

Promoterek, exon-intron határok, transzlációiniciációs helyek, terminációs helyek azonosítása, az ezekre jellemző szekvenciamintázatok alapján

Az algoritmusok jóságának két paramétere:

• Érzékenység: a valóságos funkcionális helyek mekkora részét jósolja meg helyesen
• Specificitás: a megjósolt helyek mekkora része valóságos

Különböző megközelítések:

• Konszenzusszekvencia alapján (a leggyakoribb nukleotidok megadása): nem megbízható a variabilitás miatt
• Súlymátrix megadása: minden pozícióra közöljük a 4 nukleotid gyakoriságát, ehhez hasonlítjuk az új szekvenciát. Korlátozott mértékben sikeres.
• Bonyolultabb matematikai modellek (pl. rejtett Markov-modellek). Ígéretes, de nem kiforrott.

Promoterek

• Számos program, az ismert promoterek szekvenciáinak könyvtára alapján
• Pl. TATA-box, "cap" szignál, stb.
• Kevéssé sikeres, mert pl. az emberi gének 30%-ánál nem találhatóak meg a szokásos promoterszignálok
• A sikeresség nem nagyobb, mint a kodongyakoriság-eltolódások alapján

Poliadenilációs szignál

• A gének végén, ált. AATAAA konszenzusszekvenciával, melyet egy bonyolultabb szignál követ
• A gének felénél hiányzik
• Nem megbízható

Transzlációs szignálok: start és stop kodon

• ATG (RNS-ben AUG) a start kodon, de a metionin kódja is
• Kozak-féle szabályok: a start kodon sokszor jellegzetes környezetben van, pl.
  CCGCCAUGG

  és hasonlók (súlymátrixszal leírható)

• Gyenge az érzékenység (70-80%), de nem genomiális, hanem cDNS esetében jól használható
• Stop kodon: egyértelmű

Exon-intron határok

• Az exon-intron határokon (5' vég a donor hely, 3' vég az akceptor) jellegzetes szekvenciák vannak, melyeket a spliceoszóma felismer
• Intronok szinte mindig GT-vel kezdődnek és AG-vel végződnek, ez kevés, de segít leszűkíteni a lehetőségeket
• Bonyolultabb mintázatok súlymátrixa alapján elég hatásos detektálás, de nem tökéletes
• Bonyolultabb matematikai modellek (pl. rejtett Markov) jelentős, de nem drámai javulást eredményeznek
• Leghatásosabb: együttesen alkalmazni a kodongyakoriság-vizsgálattal (80% fölé emelkedik az érzékenység)

Integrált génelemzés

• Az egyes predikciók hatékonyságát nagyon jelentősen növeli, ha a különböző algoritmusokból származó információt együttesen vesszük figyelembe. Ez vezetett az integrált génelemző programok kifejlesztéséhez
• A fenti eljárásokat egymás után alkalmazzák
• Számos ilyen program, szerver van, lásd pl. Gene Prediction Services, Gene Recognition Programs
• 90% körüli érzékenységet, ill. specificitást lehet elérni velük.

Korlátaik

• Csak néhány organizmusra létezik ilyen program
• Néhány kivétellel csak akkor működnek jól, ha csak egyetlen gén van a beadott szekvenciában
• Legtöbbször nagyon érzékenyek a szekvenálási hibákra
• Nem képesek kezelni az olyan eseteket, mint pl. alternatív splicing, átfedő gének, különleges promoterek, stb.
• Ajánlott mindegyik programot használni (más-más algoritmusokkal dolgoznak)
• Pl. a Genscan eredményessége egy 66 kilobázis méretű szakaszon:
  

  Fekete jelöli a valóságot, szürke a GenScan általi jóslást (ld. jelmagyarázat). Az LMP2 gén jóslása tökéletes, de a TAP1-et és az LMP7-et a GenScan egybeolvasztotta, a TAP2-be eggyel több exont jósolt, a DOB-nak pedig túl korán véget vetett. Az exonok túlnyomó részét mégis hibátlanul detektálta.

Webhelyek